中国深圳大学邵永红课题组Laser Photonics Rev.：利用不受衍射限制的点扫描荧光条纹提高结构光照明显微技术的分辨率

荧光显微技术广泛应用于生物医学研究，其特点是非接触、侵入性小、数据获取快速、使用特定染料标记靶向感兴趣的分子等。然而，该技术受到了光学衍射极限（即阿贝衍射极限）的限制，可达到的最高分辨率约为200 nm。因此，一系列提高分辨率的超分辨率荧光成像技术正在得到发展。结构光照明显微技术(structured illumination microscopy, SIM)因其具有快速的数据采集、装置简单、与各种荧光染料兼容、光照强度要求低等优点，被广泛应用于生物医学研究。尽管SIM具有上述成像优势，但其超分辨能力不如受激发射耗尽显微技术和随机光学重建显微技术。这是由于SIM中周期性照明图案的最大空间频率不能高于显微镜的光学传递函数的截止频率，即受到衍射限制。

为此，我们提出了一种基于时空调制的超分辨技术，即基于时空调制的激光扫描结构照明显微镜(laser scanning structured illumination microscopy, LSSIM)，以进一步提高SIM的超分辨能力。LSSIM中使用的非正弦荧光条纹是由点扫描强度调制的激发光束在样品中逐点累积产生，因此，累积条纹的空间频率由激发光束的调制频率和扫描速度共同决定，可以在样本中产生任意高频条纹，空间频率不受衍射系统的限制，理论上LSSIM可实现无限小的分辨率。随后，通过摩尔条纹效应将样本结构的高频信息频移到衍射系统通频带，这样样品的高频信息被LSSIM采用的点激发-点探测模式记录下来，通过算法重构出样本超分辨图像。所用的非线性调制函数为一个由不同阶余弦函数组合的非正弦调制函数。调制函数中的基频余弦函数分量与传统SIM中的作用相同，最多可将分辨率提高两倍。调制函数的高阶余弦分量将更高频率的信息混合到衍射系统的通频带中，从而获得超过衍射极限的更高分辨率。我们的LSSIM具有三个优点：1）激发功率低，只需常规的共聚焦显微镜激发功率；2）染料普适性，不需要特殊染料；3）LSSIM只需在商品化的激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)中增加一个电光调制器来调制激发光的光强，就可以实现LSCM的超分辨升级。除了具有超分辨能力外，LSSIM还继承了LSCM的光学切片能力，减少了焦平面外信号，提高了信噪比。本文实现的条纹最高空间频率为2ω，其中ω为常规共聚焦显微镜的截至频率。通过成像75 nm荧光珠与荧光染料染色的牛肺动脉内皮细胞的细胞微丝，证明了LSSIM的超分辨能力。实验结果表明，LSSIM将共聚焦系统的横向分辨率提高了3倍，达到79nm。总之，我们提出了一种针对点扫描类光学显微镜的超分辨方法，我们相信LSSIM技术对光学超分辨技术及其生物医学应用研究具有重要学术价值和应用价值。